E-cadherin和p16基因蛋白在鼻咽癌中的表达及意义
作者：莫武宁 黄光武 邝国乾 韦敏怡
单位：莫武宁 黄光武 邝国乾(广西医科大学一附院 附属肿瘤医院)；韦敏怡(广西医科大学一附院 病理科，广西南宁530027)
关键词：鼻咽肿瘤；E钙粘素；p16基因；免疫组化
癌症000110
摘 要：目的：探讨E-钙粘素(E-cadherin)和p16基因与鼻咽癌发生发展的关系。方法：采用免疫组化方法检测74例鼻咽癌组织和20例炎性鼻咽部组织中E-cadherin和p16基因蛋白的表达。结果：炎性组织E-cadherin和p16显著高于鼻咽癌组织(P<0.05)；E-cadherin和p16保留表达与临床分期、病灶大小无关(P>0.05)，但在颈淋巴结转移组显著低于无颈淋巴结转移组(P<0.05)。结论：本实验结果提示E-cadherin和p16基因可能与鼻咽癌的转移潜能有关，其确切作用有待于进一步研究。
, 百拇医药
分类号：R739.63 文献标识码：A
文章编号：1000-467X(2000)01-0037-03
Expression and significance of E-cadherin and
p16 gene in nasopharyngeal carcinoma
MO Wu ning,HUANG Guang wu, KUANG Guo qian, et al.
(First Affiliated Hospital, Guangxi Medical University,Nanning 530027,P.R.China )
Abstract：Objective：To investigate the possible relationship between E-cadherin, p16 suppressor gene and progression of nasopharyngeal carcinoma (NPC). Methods： Expression of E-cadherin and p16 suppressor gene were examined in 74 cases of NPC and in 20 cases of inflammatory nasopharyngeal mucosa by immunohistochemistry. Results： The reserve expression rates of E-cadherin protein and p16 protein were higher in nonneoplasm tissue than in NPC (P<0.05). No significant relationship was found between the expression rates of E-cadherin and p16 and the clinical stgage and the size of primary tumor in NPC (P>0.05). The reserve expression rates of E-cadherin and p16 protein in the patients with lymph node metastasis were lower than that in the patients without lymph-node metastasis (P<0.05). Conclusions：Abnormal expression of E-cadherin and p16 gene proteins may be associated with metastatic potentiality of NPC, but their definite function in NPC progression needs further research.
, 百拇医药
Key words：Nasopharyngeal carcinoma; p16 gene; E-cadherin; Immunohistochemistry ▲
鼻咽癌的发生发展是非常复杂的病变过程，涉及多种癌基因和抑癌基因的表达与调控。E-钙粘素(E-cadherin,E-CD)和p16基因被认为对多种肿瘤的转移有抑制作用。本文应用E-CD、p16单克隆抗体进行s-p免疫组化法检测74例鼻咽癌组织并与20例鼻咽部炎性组织进行对照，现将结果报道如下。
1材料与方法
1.1检测对象
取我院1994～1998年间初诊鼻咽癌组织的石蜡包埋标本74例，其中男52例，平均年龄43岁；女22例，平均年龄47岁。病理分型均为低分化鳞癌。按1992年福州分期标准：Ⅰ期8例，Ⅱ期19例，Ⅲ期23例，Ⅳ期24例。另取20例非肿瘤炎性鼻咽部组织蜡块标本作对照组。切片4μm备染。
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1.2试剂
E-CD(ZM-0097)和p16(ZM-0205)鼠抗人单克隆抗体为Santa Cruz公司产品，免疫组化试剂盒(s-p法)(sp9002)均由北京中山生物工程公司提供。
1.3方法
采用s-p免疫组化法，每批试验均用已知阳性片作阳性对照，用PBS代替一抗作空白对照及用非免疫正常鼠血清同等倍数稀释替代一抗作替代对照。
1.4结果判定
参照Shiozaki等[1]介绍方法，以非肿瘤炎性上皮作阳性对照进行定性分类：(1)肿瘤细胞呈保留表达：所有肿瘤细胞染棕黄色，系(+)；(2)肿瘤细胞呈异常表达形式：①异质性减弱表达：肿瘤细胞染色强度不一致，(+)和(-)者混杂存在；②消失表达：肿瘤细胞基本呈(-)。
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统计学方法用χ2检验。
2结果
2.1非癌组织和癌组织中E-CD和p16蛋白的表达(见图1～4)
图1炎性鼻咽部组织E-Cadherin蛋白阳性表达，部位在细胞膜及细胞浆DAB×400
图2鼻咽癌组织E-Cadherin蛋白异质性减弱表达，部位在细胞膜及细胞浆DAB×200
图3炎性鼻咽部组织p16蛋白阳性表达，部位在细胞核及细胞浆DAB×400
, http://www.100md.com
图4鼻咽癌组织p16蛋白阳性表达，部位在细胞核及细胞浆DAB×400
从表1可见，鼻咽癌组织的E-CD和p16的保留表达率明显低于炎性组织，差异有显著性(P<0.05)。
表1ECD和p16蛋白在鼻咽部组织的表达 鼻咽病理
n
E-CD
p16
保留表达(%)
异常表达(%)
保留表达(%)
异常表达(%)
, 百拇医药
炎症
20
20(100)
0(0)
20(100)
0(0)
低分化鳞癌
74
43(58.11)
31(41.89)
32(43.24)
42(56.76)
, 百拇医药 *异常表达包括减弱表达和基本缺失
2.2E-CD和p16表达与临床分期、原发灶大小和淋巴结转移的关系
表2显示E-CD和p16表达与临床分期、原发灶大小无关(P>0.05)，而与有无颈淋巴结转移有关。
表2 E-CD和p16蛋白表达与鼻咽癌临床分期，原发灶大小和淋巴结转的关系 项目
n
E-CD
p16
保留表达(%)
异常表达(%)
保留表达(%)
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异常表达(%)
临床分期
Ⅰ
8
6(75.00)
2(25.00)
4(50.00)
4(50.00)
Ⅱ
19
10(52.63)
9(47.37)
9(47.37)
, 百拇医药
10(52.63)
Ⅲ
23
14(60.87)
9(39.13)
9(39.13)
14(60.87)
Ⅳ
24
13(54.17)
11(45.83)
10(41.67)
, 百拇医药
14(58.33)
原发灶大小
T1
13
7(53.85)
6(46.15)
7(53.85)
6(46.15)
T2
26
16(61.54)
10(38.46)
, 百拇医药
11(42.31)
15(57.69)
T3
22
13(59.09)
9(40.91)
8(36.36)
14(63.64)
T4
13
7(53.85)
6(46.15)
, http://www.100md.com
6(46.15)
7(53.85)
淋巴结转移
无
30
23(76.67)
7(23.33)
18(60.00)
12(40.00)
有
44
20(45.54)
, 百拇医药 24(54.55)
14(31.82)
30(69.18)
无淋巴结转移组与有淋巴结转移组比较,E-CD x2=7.14,p<0.01;p16 x2=5.77.p<0.05
3讨论
3.1 E-CD与鼻咽癌发生发展关系
有报道[1，2]在某些肿瘤细胞E-CD分子明显减少。本实验以肿瘤细胞染色程度一致且与上皮组织染色强度基本一致者定为保留表达，结果显示鼻咽癌细胞中41.89%呈异常表达，其保留表达率仅58.11%，较对照组的炎性鼻咽部上皮细胞的100%表达明显减少(P<0.01)，与上述文献相符。E-CD在炎性上皮稳定表达，说明良性病变不影响ECD表达，细胞恶化可能使其表达减弱。
, http://www.100md.com
E-CD是钙依赖性细胞间连结的细胞粘附分子，其C-末端与细胞质的Caterin相连，并通过这一分子与细胞肌动蛋白微梁系统发生结构上联系。因此，它的表达程度及功能性状态直接影响着肿瘤细胞的脱离和再附着。体外实验用单克隆抗E-CD抗体处理后可使本来并无浸润能力的细胞获得浸润能力。E-CD的cDNA转染高侵袭性细胞株，可使其侵袭浸润能力消失，且可被单克隆抗E-CD抗体再次诱发。因此E-CD被认为是对肿瘤转移具有抑制作用。
已有报道[2～4]E-CD表达与肿瘤分化程度、浸润深度和淋巴结转移密切相关。本实验结果E-CD在不同的鼻咽癌临床分期及原发灶大小的组织中的保留表达，差异不显著，看不出其与肿瘤局部浸润的相关性。但有颈部淋巴结转移者E-CD保留表达率明显低于尚无颈淋巴结转移组(P<0.01)，这是否说明E-CD在鼻咽癌细胞中表达减弱和/或消失，从而导致细胞间连结紊乱，进而促进癌细胞从原发灶脱落、转移，需要进一步研究证实。
3.2p16与鼻咽癌的关系
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P16蛋白是一种已知的细胞周期依赖性激酶(CDK4)的抑制因子，控制细胞分裂。当P16基因缺失、突变或表达不正常时，细胞分裂、增殖失控，向癌变方向发展。实验发现p16的缺失导致肿瘤细胞无限生长，而用p16转染有p16缺失的癌细胞系列则癌细胞出现生长抑制[5]。p16基因的变化在多种人类恶性肿瘤中存在[6],突变率为25%～85%，这提示p16基因突变失活在肿瘤的发生中起重要作用。本研究结果显示鼻咽癌组织p16蛋白保留表达率较鼻咽部粘膜炎性上皮明显降低(P<0.01)，与Lo等[7]用比较多重PCR分析鼻咽癌，在2/3(76%)异种移植物和7/20(35%)原发瘤中有p16纯合缺失的结果相似，提示p16基因丢失在鼻咽癌发生中起重要作用。
有报道[8,9]p16基因表达下降与肿瘤细胞浸润、转移有关。本实验显示p16保留表达与临床分期、原发灶大小无关，而在有淋巴结转移组显著低于不伴有淋巴结转移组，提示p16低表达或失表达可能与鼻咽癌的颈部转移有关。
, http://www.100md.com
肿瘤的发生发展是一个多因素参与的极复杂多步骤过程，E-CD和p16基因表达在鼻咽癌中的作用可为基因治疗提供依据，有进一步研究价值。
基金项目：本课题受广西区科委基金(桂科字981103)资助
*通讯作者：Tel：86-771-5883218
E-mail：gwhuong@263.net
参考文献：
[1]Shiozaki H,Tahara H, Oka H, et al. Expression of immuno-reactive E-cadherin adhesion molecules in human cancers[J]. Am J Pathol,1991, 139： 17～ 23.
, http://www.100md.com
[2]Mohri Y. Prognostic significance of E-cadherin expression in human colorectal cancer tissue[J]. Surg today, 1997,27： 606～ 612.
[3]Hunt NC, Dougla-Jones AG, Jasani B, et al. Loss of E-cadherin expression associated with lymph node metastases in small breast carcinomas[J]. Vichows Arch,1997,430： 285～ 289.
[4]Richmond PJ, Karayiannakis AJ, Nagafuchi A, et al. Aberrant E-cadherin and alpha-catenin expression in prostate cancer： correlation with patient survival[J]. Cancer Res,1997,57： 3189～ 3193.
, 百拇医药
[5]Okamoto A, Demetrick DJ, Spillare EA, et al. Mutations and altered expression of p16 (INK4) in human cancer[J]. Proc Natl Acad Sci USA,1994, 19： 11045～ 11049.
[6]Nobori T, Miura K, Wu DJ,et al.Deletions of the cyclin-dependent kinase-4 inhibitor gene in multiple human cancers[J]. Nature,1994, 368： 753～ 756.
[7]Lo KW, Huang DP, Lau K M, et al. p16 gene altertions in nasopharyngeal carcinoma[J]. Cancer Res,1995,55： 2039～ 2043.
, 百拇医药
[8]Reed JA ,Loganzo F, Shea CR, et al. Loss of expression of the p16 cyclin-dependent kinase inhibitor 2 tumor suppressor gene in melanocytic lesions correlates with invasive stage of tumor progression[J]. Cancer Res,1995,55： 2713～ 2718.
[9] 任重，王琰，费声重.p16抑癌基因在喉癌中的表达及其与癌恶性度和颈淋巴结转移的关系(摘要)[J].中华耳鼻喉科杂志，1997,32：51.
收稿日期：1998-12-03
修回日期：1999-05-27, 百拇医药
单位：莫武宁 黄光武 邝国乾(广西医科大学一附院 附属肿瘤医院)；韦敏怡(广西医科大学一附院 病理科，广西南宁530027)
关键词：鼻咽肿瘤；E钙粘素；p16基因；免疫组化
癌症000110
摘 要：目的：探讨E-钙粘素(E-cadherin)和p16基因与鼻咽癌发生发展的关系。方法：采用免疫组化方法检测74例鼻咽癌组织和20例炎性鼻咽部组织中E-cadherin和p16基因蛋白的表达。结果：炎性组织E-cadherin和p16显著高于鼻咽癌组织(P<0.05)；E-cadherin和p16保留表达与临床分期、病灶大小无关(P>0.05)，但在颈淋巴结转移组显著低于无颈淋巴结转移组(P<0.05)。结论：本实验结果提示E-cadherin和p16基因可能与鼻咽癌的转移潜能有关，其确切作用有待于进一步研究。
, 百拇医药
分类号：R739.63 文献标识码：A
文章编号：1000-467X(2000)01-0037-03
Expression and significance of E-cadherin and
p16 gene in nasopharyngeal carcinoma
MO Wu ning,HUANG Guang wu, KUANG Guo qian, et al.
(First Affiliated Hospital, Guangxi Medical University,Nanning 530027,P.R.China )
Abstract：Objective：To investigate the possible relationship between E-cadherin, p16 suppressor gene and progression of nasopharyngeal carcinoma (NPC). Methods： Expression of E-cadherin and p16 suppressor gene were examined in 74 cases of NPC and in 20 cases of inflammatory nasopharyngeal mucosa by immunohistochemistry. Results： The reserve expression rates of E-cadherin protein and p16 protein were higher in nonneoplasm tissue than in NPC (P<0.05). No significant relationship was found between the expression rates of E-cadherin and p16 and the clinical stgage and the size of primary tumor in NPC (P>0.05). The reserve expression rates of E-cadherin and p16 protein in the patients with lymph node metastasis were lower than that in the patients without lymph-node metastasis (P<0.05). Conclusions：Abnormal expression of E-cadherin and p16 gene proteins may be associated with metastatic potentiality of NPC, but their definite function in NPC progression needs further research.
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Key words：Nasopharyngeal carcinoma; p16 gene; E-cadherin; Immunohistochemistry ▲
鼻咽癌的发生发展是非常复杂的病变过程，涉及多种癌基因和抑癌基因的表达与调控。E-钙粘素(E-cadherin,E-CD)和p16基因被认为对多种肿瘤的转移有抑制作用。本文应用E-CD、p16单克隆抗体进行s-p免疫组化法检测74例鼻咽癌组织并与20例鼻咽部炎性组织进行对照，现将结果报道如下。
1材料与方法
1.1检测对象
取我院1994～1998年间初诊鼻咽癌组织的石蜡包埋标本74例，其中男52例，平均年龄43岁；女22例，平均年龄47岁。病理分型均为低分化鳞癌。按1992年福州分期标准：Ⅰ期8例，Ⅱ期19例，Ⅲ期23例，Ⅳ期24例。另取20例非肿瘤炎性鼻咽部组织蜡块标本作对照组。切片4μm备染。
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1.2试剂
E-CD(ZM-0097)和p16(ZM-0205)鼠抗人单克隆抗体为Santa Cruz公司产品，免疫组化试剂盒(s-p法)(sp9002)均由北京中山生物工程公司提供。
1.3方法
采用s-p免疫组化法，每批试验均用已知阳性片作阳性对照，用PBS代替一抗作空白对照及用非免疫正常鼠血清同等倍数稀释替代一抗作替代对照。
1.4结果判定
参照Shiozaki等[1]介绍方法，以非肿瘤炎性上皮作阳性对照进行定性分类：(1)肿瘤细胞呈保留表达：所有肿瘤细胞染棕黄色，系(+)；(2)肿瘤细胞呈异常表达形式：①异质性减弱表达：肿瘤细胞染色强度不一致，(+)和(-)者混杂存在；②消失表达：肿瘤细胞基本呈(-)。
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统计学方法用χ2检验。
2结果
2.1非癌组织和癌组织中E-CD和p16蛋白的表达(见图1～4)
图1炎性鼻咽部组织E-Cadherin蛋白阳性表达，部位在细胞膜及细胞浆DAB×400
图2鼻咽癌组织E-Cadherin蛋白异质性减弱表达，部位在细胞膜及细胞浆DAB×200
图3炎性鼻咽部组织p16蛋白阳性表达，部位在细胞核及细胞浆DAB×400
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图4鼻咽癌组织p16蛋白阳性表达，部位在细胞核及细胞浆DAB×400
从表1可见，鼻咽癌组织的E-CD和p16的保留表达率明显低于炎性组织，差异有显著性(P<0.05)。
表1ECD和p16蛋白在鼻咽部组织的表达 鼻咽病理
n
E-CD
p16
保留表达(%)
异常表达(%)
保留表达(%)
异常表达(%)
, 百拇医药
炎症
20
20(100)
0(0)
20(100)
0(0)
低分化鳞癌
74
43(58.11)
31(41.89)
32(43.24)
42(56.76)
, 百拇医药 *异常表达包括减弱表达和基本缺失
2.2E-CD和p16表达与临床分期、原发灶大小和淋巴结转移的关系
表2显示E-CD和p16表达与临床分期、原发灶大小无关(P>0.05)，而与有无颈淋巴结转移有关。
表2 E-CD和p16蛋白表达与鼻咽癌临床分期，原发灶大小和淋巴结转的关系 项目
n
E-CD
p16
保留表达(%)
异常表达(%)
保留表达(%)
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异常表达(%)
临床分期
Ⅰ
8
6(75.00)
2(25.00)
4(50.00)
4(50.00)
Ⅱ
19
10(52.63)
9(47.37)
9(47.37)
, 百拇医药
10(52.63)
Ⅲ
23
14(60.87)
9(39.13)
9(39.13)
14(60.87)
Ⅳ
24
13(54.17)
11(45.83)
10(41.67)
, 百拇医药
14(58.33)
原发灶大小
T1
13
7(53.85)
6(46.15)
7(53.85)
6(46.15)
T2
26
16(61.54)
10(38.46)
, 百拇医药
11(42.31)
15(57.69)
T3
22
13(59.09)
9(40.91)
8(36.36)
14(63.64)
T4
13
7(53.85)
6(46.15)
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6(46.15)
7(53.85)
淋巴结转移
无
30
23(76.67)
7(23.33)
18(60.00)
12(40.00)
有
44
20(45.54)
, 百拇医药 24(54.55)
14(31.82)
30(69.18)
无淋巴结转移组与有淋巴结转移组比较,E-CD x2=7.14,p<0.01;p16 x2=5.77.p<0.05
3讨论
3.1 E-CD与鼻咽癌发生发展关系
有报道[1，2]在某些肿瘤细胞E-CD分子明显减少。本实验以肿瘤细胞染色程度一致且与上皮组织染色强度基本一致者定为保留表达，结果显示鼻咽癌细胞中41.89%呈异常表达，其保留表达率仅58.11%，较对照组的炎性鼻咽部上皮细胞的100%表达明显减少(P<0.01)，与上述文献相符。E-CD在炎性上皮稳定表达，说明良性病变不影响ECD表达，细胞恶化可能使其表达减弱。
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E-CD是钙依赖性细胞间连结的细胞粘附分子，其C-末端与细胞质的Caterin相连，并通过这一分子与细胞肌动蛋白微梁系统发生结构上联系。因此，它的表达程度及功能性状态直接影响着肿瘤细胞的脱离和再附着。体外实验用单克隆抗E-CD抗体处理后可使本来并无浸润能力的细胞获得浸润能力。E-CD的cDNA转染高侵袭性细胞株，可使其侵袭浸润能力消失，且可被单克隆抗E-CD抗体再次诱发。因此E-CD被认为是对肿瘤转移具有抑制作用。
已有报道[2～4]E-CD表达与肿瘤分化程度、浸润深度和淋巴结转移密切相关。本实验结果E-CD在不同的鼻咽癌临床分期及原发灶大小的组织中的保留表达，差异不显著，看不出其与肿瘤局部浸润的相关性。但有颈部淋巴结转移者E-CD保留表达率明显低于尚无颈淋巴结转移组(P<0.01)，这是否说明E-CD在鼻咽癌细胞中表达减弱和/或消失，从而导致细胞间连结紊乱，进而促进癌细胞从原发灶脱落、转移，需要进一步研究证实。
3.2p16与鼻咽癌的关系
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P16蛋白是一种已知的细胞周期依赖性激酶(CDK4)的抑制因子，控制细胞分裂。当P16基因缺失、突变或表达不正常时，细胞分裂、增殖失控，向癌变方向发展。实验发现p16的缺失导致肿瘤细胞无限生长，而用p16转染有p16缺失的癌细胞系列则癌细胞出现生长抑制[5]。p16基因的变化在多种人类恶性肿瘤中存在[6],突变率为25%～85%，这提示p16基因突变失活在肿瘤的发生中起重要作用。本研究结果显示鼻咽癌组织p16蛋白保留表达率较鼻咽部粘膜炎性上皮明显降低(P<0.01)，与Lo等[7]用比较多重PCR分析鼻咽癌，在2/3(76%)异种移植物和7/20(35%)原发瘤中有p16纯合缺失的结果相似，提示p16基因丢失在鼻咽癌发生中起重要作用。
有报道[8,9]p16基因表达下降与肿瘤细胞浸润、转移有关。本实验显示p16保留表达与临床分期、原发灶大小无关，而在有淋巴结转移组显著低于不伴有淋巴结转移组，提示p16低表达或失表达可能与鼻咽癌的颈部转移有关。
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肿瘤的发生发展是一个多因素参与的极复杂多步骤过程，E-CD和p16基因表达在鼻咽癌中的作用可为基因治疗提供依据，有进一步研究价值。
基金项目：本课题受广西区科委基金(桂科字981103)资助
*通讯作者：Tel：86-771-5883218
E-mail：gwhuong@263.net
参考文献：
[1]Shiozaki H,Tahara H, Oka H, et al. Expression of immuno-reactive E-cadherin adhesion molecules in human cancers[J]. Am J Pathol,1991, 139： 17～ 23.
, http://www.100md.com
[2]Mohri Y. Prognostic significance of E-cadherin expression in human colorectal cancer tissue[J]. Surg today, 1997,27： 606～ 612.
[3]Hunt NC, Dougla-Jones AG, Jasani B, et al. Loss of E-cadherin expression associated with lymph node metastases in small breast carcinomas[J]. Vichows Arch,1997,430： 285～ 289.
[4]Richmond PJ, Karayiannakis AJ, Nagafuchi A, et al. Aberrant E-cadherin and alpha-catenin expression in prostate cancer： correlation with patient survival[J]. Cancer Res,1997,57： 3189～ 3193.
, 百拇医药
[5]Okamoto A, Demetrick DJ, Spillare EA, et al. Mutations and altered expression of p16 (INK4) in human cancer[J]. Proc Natl Acad Sci USA,1994, 19： 11045～ 11049.
[6]Nobori T, Miura K, Wu DJ,et al.Deletions of the cyclin-dependent kinase-4 inhibitor gene in multiple human cancers[J]. Nature,1994, 368： 753～ 756.
[7]Lo KW, Huang DP, Lau K M, et al. p16 gene altertions in nasopharyngeal carcinoma[J]. Cancer Res,1995,55： 2039～ 2043.
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[8]Reed JA ,Loganzo F, Shea CR, et al. Loss of expression of the p16 cyclin-dependent kinase inhibitor 2 tumor suppressor gene in melanocytic lesions correlates with invasive stage of tumor progression[J]. Cancer Res,1995,55： 2713～ 2718.
[9] 任重，王琰，费声重.p16抑癌基因在喉癌中的表达及其与癌恶性度和颈淋巴结转移的关系(摘要)[J].中华耳鼻喉科杂志，1997,32：51.
收稿日期：1998-12-03
修回日期：1999-05-27, 百拇医药